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【导语】近日，上海师范大学生命科学学院芦银华研究员团队在《中国科学：生命科学》英文版上发表了重要研究成果。该研究首次在非模式工业放线菌——刺糖多孢菌中，成功建立了基于内源I-B型CRISPR/Cas系统的高效基因组编辑工具。这一突破不仅解决了刺糖多孢菌长期面临的遗传操作难题，还为其他难以改造的工业微生物提供了新的编辑思路。刺糖多孢菌是生产环境友好型杀虫剂多杀菌素的关键菌株，该研究成果有望推动其高产育种进程，提升生物农药的生产效率。

近日，上海师范大学生命科学学院芦银华研究员(yuán)团(tuán)队(duì)在(zài)《中(zhōng)国(guó)科(kē)学(xué)：生(shēng)命(mìng)科(kē)学(xué)》英(yīng)文版(bǎn)发(fā)表(biǎo)重(zhòng)要(yào)研(yán)究(jiū)成(chéng)果(guǒ)，首(shǒu)次(cì)在(zài)非(fēi)模(mó)式(shì)工(gōng)业(yè)放(fàng)线(xiàn)菌(jūn)中(zhōng)建(jiàn)立(lì)了(le)一(yī)种(zhǒng)基(jī)于(yú)内(nèi)源(yuán)I-B型(xíng)CRISPR/Cas系(xì)统(tǒng)的(de)高(gāo)效(xiào)基(jī)因(yīn)组(zǔ)编(biān)辑(ji)工(gōng)具(jù)，解(jiě)决(jué)了(le)工(gōng)业(yè)放(fàng)线(xiàn)菌(jūn)刺(cì)糖(táng)多(duō)孢(bāo)菌(jūn)（Saccharopolyspora spinosa）长(zhǎng)期(qī)面(miàn)临(lín)的(de)遗(yí)传(chuán)操(cāo)作(zuò)难(nán)题(tí)，也(yě)为(wèi)其(qí)他(tā)难(nán)以(yǐ)改(gǎi)造(zào)的(de)工(gōng)业(yè)微(wēi)生(shēng)物(wù)提(tí)供(gōng)了(le)新(xīn)思(sī)路。

刺(cì)糖(táng)多(duō)孢(bāo)菌(jūn)是(shì)生(shēng)产(chǎn)绿(lǜ)色(sè)生(shēng)物(wù)农(nóng)药(yào)多(duō)杀(shā)菌(jūn)素(sù)的重要工业菌株。多杀菌素具有高效、广谱的杀虫活性，且哺乳动物细胞毒性低、安全性高，是一种“环境友好型”杀虫剂。然而，刺糖多孢菌转化效率低、遗传工具匮乏，导致其代谢工程改造困难重重，产能瓶颈难以解决。依赖外源CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术虽然已在诸多物种取得突破，但针对工业微生物，依然面临转化效率低、宿主毒性强等问题，难以广泛应用。研究团队另辟蹊径，巧用细菌“原生剪刀”——内源I-B型CRISPR/Cas系统，通过生物信息学分析和实验验证，确定了该系统识别的PAM序列（基因切割的“定位信号”）（图1）。通过重编程靶向自身基因组的微型CRISPR阵列，建立新(xīn)型(xíng)编辑工具，成功实现高效的基因敲除。该方法无需导入外源Cas蛋白，编辑质粒更小、毒性更低。

图1. 刺糖(táng)多(duō)孢(bāo)菌(jūn)内(nèi)源Type I-B型CRISPR/Cas系统。

（A）刺糖多孢(bāo)菌(jūn)内(nèi)源(yuán)CRISPR/Cas系(xì)统(tǒng)组(zǔ)成(chéng)及(jí)转(zhuǎn)录(lù)分(fēn)析(xī)。（B）I-B型(xíng)CRISPR/Cas系(xì)统(tǒng)组(zǔ)成(chéng)的(de)Cascade复(fù)合(hé)体(tǐ)在(zài)crRNA引(yǐn)导(dǎo)下(xià)靶(bǎ)向(xiàng)DNA示(shì)意(yì)图(tú)。Cascade复(fù)合(hé)体(tǐ)由(yóu)Cas11、Cas8、Cas7、Cas6、Cas5等(děng)蛋(dàn)白(bái)组(zǔ)成(chéng)。在PAM被Cas8识别后，Cascade结合到目标DNA上，招募Cas3在原间隔区内切割目标DNA的非靶向链。（C）WebLogo显示的介导CRISRP/Cas系统DNA切割功能的可能PAM序列。

另外，刺糖多孢菌具有多种RM防御系统，如同“分子守卫”般切割外来DNA，导致质粒转化效率极低。研究团队利用新开发的基因敲除工具，逐一敲除关键RM系统，得到一株转化效率显著提高的工程菌株，这为后续的遗传操作扫清了障碍。在此基础上，实现了荧光报告基因mCherry的高效插入，以及长达75 kb的多杀菌素生物合成基因簇的成功敲除（图2）。这些结果显示该工具针对单基因以及基因簇强大的编辑能力，为刺糖多孢菌高产育种提供了必要的技术支撑。

图2. 基于内源CRISPR系统的高效基因组编辑技术应用于外源基因插入及刺糖多孢菌基因簇大片段敲除。

（A）构建敲除质粒，实现对目标基因簇敲除示意图。（B）基因簇敲除菌落PCR鉴定，上图为基因簇外侧引物PCR验证，下图为利用基因簇内部引物PCR验证。（C）基因簇敲除菌株的Sanger测序验证。（D）mCherry插入刺糖多孢菌基因组示意图。mCherry插入菌落PCR鉴定（E）及测序验证（F）。